Метод грама - техника проведения окраски. Окраска по граму Грамположительные бактерии при окраске имеют цвет

Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки. По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (Грам(+)) и грамотрицательные (Грам(-)). Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году, и с того времени не утратил популярности, хотя и неоднократно модифицировался.

Структура клеточной стенки

Окрашивание по Граму позволяет выявить, к грамположительным или грамотрицательным относится та или иная бактерия. Деление бактерий на Грам(+) и Грам(-) осуществляется в соответствие со строением их клеточной стенки.

Клеточная стенка в наибольшем количестве содержит пептидогликан (муреин) - сложное вещество, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных друг с другом β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клетки, осмотическую защиту, а также антигенные функции.

Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий

У различных бактерий толщина слоя пептидогликана не одинакова. У бактерий, которые относят к грамположительным, она составляет от 15 до 80 нм, в то время как у грамотрицательных - от 2 до 8 нм. В то же время у грамотрицательных бактерий под слоем пептидогликана есть особая структура, которой нет у грамположительных бактерий - периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами - β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Именно эти ферменты ответственны за резистентность грамотрицательных бактерий в отношении многих антибиотиков.

Слой пептидогликана Грам(-) бактерий связан с липополисахаридом - антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У Грам(+) бактерий похожие функции выполняют тейхоевые кислоты.

У присутствует дополнительная структура - внешняя мембрана.

Суть метода окрашивания

Перед тем как начать окрашивание, готовят мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и бактериальной петлей добавляют туда культуру микроорганизмов. Затем, после полного высыхания воды, мазок фиксируют - предметное стекло проносят несколько раз над пламенем горелки. Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий - с мертвыми клетками лучше связываются молекулы красителя.

Окрашивание производится в несколько этапов:

Причины различного характера окрашивания

Как было описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный или розовый. Причина дифференциального окрашивания бактерий по этому методу состоит в том, что после попадания в клетку растворимой формы генцианвиолета краситель переходит в нерастворимую йодную форму. Во время обработки бактерии этиловым спиртом под действием этого неполярного растворителя из мембраны экстрагируются липиды. После этого мембрана становится пористой и больше не является существенным препятствием для вымывания красителя. Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.

Тонкий муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными - окрашиваются грамотрицательно.

После воздействия на мазок фуксином при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные приобретают розово-красный оттенок.

Примеры Грам(+) и Грам(-) бактерий

К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.

Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.

Окрашивание по Граму - это экспрессный метод исследования, позволяющий установить наличие бактерий в образце и дифференцировать их как грамположительные либо грамотрицательные. Метод основан на химических и физических свойствах клеточной оболочки. Метод Грама почти всегда применяют в качестве первого шага при диагностике бактериальных инфекций .

Метод был предложен датским ученым Г.К.Грамом , который разработал его в 1882 и опубликовал в 1884 году, как способ, позволяющий дифференцировать сходные по симптомам бактериальные инфекции: Streptococcus pneumoniae (пневмококк) и Klebsiella pneumoniae .

Шаги

Часть 1

Приготовьтесь к работе. Наденьте перчатки и подвяжите длинные волосы, чтобы не загрязнить исследуемый образец. Выберите рабочее место под вытяжкой или в другом хорошо проветриваемом месте и продезинфицируйте его. Прежде чем приступить к работе, проверьте, исправны ли горелка Бунзена и оптический микроскоп.

Продезинфицируйте предметное стекло. Если предметное стекло недостаточно чистое, вымойте его водой с мылом, чтобы удалить жир и грязь. После этого продезинфицируйте его этанолом, очистителем для стекол или другим способом, который принят в вашей лаборатории.

Поместите образец на предметное стекло. Окрашивание по Граму позволяет увидеть отдельные бактерии в медицинских образцах или культуры бактерий в чашке Петри. Для начала нанесите на предметное стекло тонкий слой исследуемой жидкости. Рекомендуется не выдерживать образец дольше 24 часов, так как со временем у бактерий повреждаются клеточные стенки, и их реакция на окрашивание по Граму становится менее предсказуемой.

Зафиксируйте образец. Под действием тепла бактерии пристанут к стеклу, и их не смоет при окрашивании. Быстро проведите 2-3 раза предметным стеклом над верхней частью пламени горелки или нагрейте его на электрическом нагревателе. Не перегрейте предметное стекло, чтобы не внести изменения в образец. Если вы используете горелку Бунзена, следите, чтобы пламя было небольшим и имело вид голубого конуса, а не высокого оранжевого столба.

• Можно зафиксировать препарат и метанолом. Нанесите на высушенный образец 1-2 капли метилового спирта, слейте излишки спирта и высушите предметное стекло на воздухе. Данный способ предпочтительнее в силу того, что он меньше повреждает исследуемые клетки и дает более чистый фон.

1. Поместите предметное стекло в лоток для окрашивания. Этот лоток представляет собой неглубокое металлическое, стеклянное или пластиковое блюдце с мелкой сеткой для поддержки образцов. Положите стекло с препаратом на сетку, так чтобы используемая при окраске жидкость стекала в лоток.

   Нанесите на образец йод, затем смойте его. С помощью пипетки покройте образец йодом. Оставьте йод хотя бы на 60 секунд, после чего аккуратно смойте его водой так же, как раньше смыли краситель. Йод в виде отрицательно заряженных ионов взаимодействует с ионами КФ+, в результате чего во внешних и внутренних слоях клеток формируются крупные комплексы кристаллвиолета и йода. Это фиксирует попавший в клетки кристаллвиолет.

   • Йод является едким веществом. Избегайте контакта йода с кожей, не глотайте его и не вдыхайте его пары.

2. Добавьте обесцвечивающее вещество и сразу же смойте его. Обычно используют смесь ацетона и этанола в пропорции 1:1, при этом следует аккуратно выдержать время. Расположите предметное стекло под углом и добавляйте на него обесцвечивающее средство до тех пор, пока стекающая жидкость не потеряет фиолетовый оттенок и станет прозрачной. Обычно это занимает не более 10 секунд, особенно если обесцвечивающий раствор содержит большое количество ацетона. Если вы вовремя не остановитесь, раствор может вымыть краситель как из грамположительных, так и грамотрицательных клеток, и вам придется повторить процедуру окрашивания. Немедленно смойте остатки обесцвечивающего раствора так же, как делали это ранее с красителем.

   Нанесите на образец контрастный краситель и смойте его водой. Контрастный краситель, в качестве которого используют обычно сафранин или фуксин, позволяет получить дополнительный контраст между грамположительными и грамотрицательными клетками за счет того, что окрашивает бесцветные (грамотрицательные) бактерии в розовый или красный цвет. Оставьте контрастный краситель на образце хотя бы на 45 секунд, после чего смойте его водой.

   Высушите предметное стекло. Можно просто оставить его на воздухе, либо промокнуть фильтровальной бумагой. После этого окрашивание по Граму завершено.

Часть 3

Подготовьте оптический микроскоп. Положите стекло с образцом на предметный столик. Бактерии значительно различаются по размерам, поэтому вам может понадобиться увеличение от 400x до 1000x. При тысячекратном увеличении для лучшего контраста рекомендуется использовать объектив с масляной иммерсией. Нанесите на предметное стекло каплю иммерсионного масла, и при этом старайтесь, чтобы стекло не двигалось, иначе в масле могут образоваться пузырьки. Затем с помощью турели микроскопа выставьте необходимый вам объектив так, чтобы он коснулся масла.

• Метод масляной иммерсии применим лишь для специальных, а не "сухих" объективов.

1. Определите грамположительные и грамотрицательные бактерии. Рассмотрите предметное стекло под оптическим микроскопом. Грамположительные бактерии будут окрашены в фиолетовый цвет, поскольку внутри их толстых клеточных стенок оказался кристаллвиолет. Грамотрицательные бактерии должны быть розовыми или красными, так как кристаллвиолет был вымыт через их тонкие клеточные стенки, после чего в них проник розовый контрастный краситель.

   • Если образец слишком толст, это может привести к ошибочным положительным результатам. Если бактерии всех типов выглядят как грамположительные, окрасьте еще один образец, чтобы удостовериться в правильности результатов.
   • Если образец слишком долго находился под воздействием обесцвечивающего раствора, это может привести к ошибочным отрицательным результатам. Окрасьте еще один образец, чтобы убедиться в том, что все бактерии действительно грамотрицательные.

2. Сравните свои результаты с эталонными изображениями. Если вы не уверены в том, какие бактерии видите, то просмотрите набор эталонных изображений, которые отсортированы по форме бактерий и результатам окрашивания по Граму. Подобный набор можно найти в Интернете на National Microbial Pathogen Database , Bacteria in Photos и многих других сайтах. Ниже приведены наиболее распространенные или важные для диагностики примеры, которые помогут вам идентифицировать бактерии.

   Распознайте грамположительные бактерии по форме. Вид бактерий можно определить по их форме в микроскопе: часто это бывают кокки (округлые) и бациллы (палочковидные). Вот несколько распространенных форм грамположительных (фиолетовых) бактерий:

   Распознайте грамотрицательные бактерии. Часто грамотрицательные (розовые) бактерии разделяют на три группы: кокки (округлые), палочковидные (длинные и тонкие) и кокковидные, которые имеют промежуточную форму.

   Оцените неоднозначные результаты. Некоторые бактерии не поддаются однозначному окрашиванию из-за того, что их клеточные стенки непрочны или покрыты жирами. Такие бактерии могут одновременно окрашиваться в фиолетовый и розовый цвет в пределах одной клетки, либо клетки одного и того же вида могут окрашиваться по-разному в одном мазке. Подобная проблема может наблюдаться на любом образце бактерий, который пролежал более 24 часов, однако некоторые виды бактерий подвержены этому независимо от свежести образца. В этом случае для точного определения бактерий могут понадобиться более специализированные методы, такие как окраска по Цилю-Нильсену, наблюдение за ростом культуры, тест TSI (тройной сахар железа), генетическое тестирование.

   Выбросьте использованные материалы. Процедура утилизации отходов зависит от конкретной лаборатории и того, какие материалы использовались. Как правило, жидкость из лотка для окрашивания считается опасным материалом и переливается в плотно закрывающиеся бутылки. Использованные предметные стекла вымачиваются в 10%-ном растворе отбеливателя, после чего помещаются в контейнеры для сбора и утилизации игл и медицинских отходов.

Что вам понадобится

• Образец ткани
• Стеклянные предметные стекла
• Пипетка
• Источник пламени, нагреватель предметных стекол или метанол
• Кристаллический фиолетовый
• Обесцвечивающая жидкость, например спирт или ацетон
• Сафранин

Дополнительные статьи

источников

1. Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey"s Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). Lippincott Williams & Wilkins.
2. Gram, HC (1884). "Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten" (in German). Fortschritte der Medizin 2: 185–9.
3. http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/2886-gram-stain-protocols
4. http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=2
5. http://www.austincc.edu/microbugz/gram_stain.php
6. http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=2
7. http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=2

окрасить мазок генцианвиолетом (2 минуты,через фильтровальную бумагу);

бумагу удалить, оставшуюся краску слить;

окрасить мазок раствором Люголя (1 минута);

раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (30-40 секунд, осторожно покачивать стекло);

тщательно смыть спирт водой;

окрасить водным фуксином (2 минуты);

промыть водой и высушить.

Грам-положительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, Грам-отрицательные – вкрасный Окраска кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной к неорганическим кислотам, спиртам, щелочам. Это связано с наличием в клеточной стенке и мембране сравнительно большого количества липидов. Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными способами, поэтому используют концентрированные растворы с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой клетки, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии. Их окрашивают по методу Циля-Нильсена, который разработан с учетом все указанных особенностей Окраска по Цилю-Нильсену. Методика:

нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок. Покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 минут);

бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 3% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом (3-4 секунды);

тщательно промыть водой;

окрасить дефферовской синькой (3-5 минут);

промыть водой и высушить.

Окаска спор. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за низкой проницаемости стенки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микроба, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее клетки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при испольщовании концентрированного раствора краски в подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску. Метод Ожешко.

нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 минуты);

слить кислоту, промыть водой, высушить;

зафиксировать в пламени;

окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий). Часто для окраски спор используют только метод Циля-Нильсена.

Окраска включения волютина (по Нейссеру).

Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 минуты);

• Окрасить раствором Люголя (30 секунд);

  Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 минута)

  Промыть препарат и высушить

Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, принимает желтый цвет. Зерна волютина – темно-синие, почти черные. Окраска по Бурри (обнаружение капсул).

Для обнаружения капсул используют негативную окраску, т.к. окрашивается пространство между бактериями. Таким образом, образуется темное поле с не окрашенными бактериями.

Смешать на предметном стелке немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши;

Высушить на воздухе и бактериоскопировать.

Модификация по Бурри-Гинсу включает создание фона краской конгорот, последующую фиксацию в 5% растворе соляной кислоты, дополнительную окраску водным фуксином. В результате – общий фон темный, капсулы бесцветны, сами бактерии – красные.

№6 Устройство светового микроскопа и техника иммерсионной микроскопии.

ГРАМА МЕТОД (Н. Ch. J. Gram, датский врач, 1853-1938) - дифференциальная окраска бактерий; применяется для окраски бактерий в мазках из культур, экссудатов, тканей и пр. Метод предложен в 1884 г. и получил широкое распространение в бактериологии.

Сущность метода состоит в том, что при слабощелочной реакции бактерии окрашиваются основными красителями трифенилметановой группы (генцианвиолет, кристаллвиолет, метилвиолет). Обработка йодом или пикриновой к-той приводит к прочной фиксации красителя в определенных видах бактерий; последующее промывание окрашенного препарата нейтральным спиртом или ацетоном не обесцвечивает их (грамположительные бактерии). У других бактерий под влиянием йода не образуется прочного комплекса, и обработка спиртом или ацетоном приводит к обесцвечиванию. Эти бактерии (грамотрицательные) выявляются путем докрашивания контрастной краской. Грамположительность и грамотрицательность - важный диагностический признак в дифференциальной диагностике некоторых инфекционных заболеваний.

При окраске тканей по Г. м. клеточные структуры (за исключением хроматина делящихся ядер зернышек, базофильных клеток и рогового слоя эпидермиса) обесцвечиваются спиртом. Окраска по Граму вариабельна и зависит от многих факторов. Поэтому для получения точных и сравнимых результатов всегда следует придерживаться стандартной методики. Для фиксации препарата чаще используют высокую температуру, хотя могут быть применены и другие способы (см. Фиксация). Следует учитывать, что способ фиксирования влияет на ход окраски. Лучшими основными красителями для этого метода являются метилвиолет, генцианвиолет (см.) и др. Удовлетворительные результаты дают также основной фуксин, виктория синяя и др. В качестве протравы обычно применяют йод или пикриновую к-ту, но могут быть использованы бром, двухромовокислый калий, тринитрокрезол и др. Из обесцвечивающих агентов чаще применяют этиловый спирт и ацетон. Ацетон более активен в качестве средства, обесцвечивающего грамотрицательные бактерии. Используется также смесь из этих веществ.

Некоторые бактерии (Corynebacterium diphtheriae, Shigella dysenteriae, Вас. proteus) характеризуются грамнеустойчивостью, т. е. они находятся между безусловно грамположительными и безусловно грамотрицательными видами; отдельные клетки одного и того же вида также подвержены аналогичным колебаниям. Напр., в цепочке альфа-гемолитического стрептококка среди грамположительных кокков часто можно наблюдать грамотрицательную клетку. Особое влияние на окраску оказывает возраст культуры. Грампозитивность уменьшается с возрастом бактерии. Поэтому в старых культурах грамположительных видов обнаруживают большое количество грамотрицательных клеток. Мертвые и частично подвергшиеся аутолизу бактериальные клетки грамотрицательны. Результат окраски зависит от среды, в к-рой выращивается микроб. При оценке полученных данных, особенно в тех случаях, когда в грамотрицательных культурах обнаруживают грамположительные клетки, необходимо учитывать толщину мазка, влияющую на результат окраски. Желательно, чтобы толщина мазка была не больше толщины одной клетки, т. к. в толстом мазке, содержащем грамотрицательные микробы, часто наблюдаются грамположительные особи.

Техника окраски по Граму

Для окраски необходимо следующее: карболовый р-р красителя трифенилметановой группы (генцианвиолет, кристаллвиолет или метилвиолет); р-р Люголя (2 г йодистого калия, 1 г йода кристаллического, 300 мл дистиллированной воды) щелочной или нейтральной реакции; спирт 96% нейтральной реакции; р-р контрастной краски (фуксин Пфейффера, 1% водный р-р нейтральрота и др.).

Мазок, фиксированный жаром, окрашивают генцианвиолетом или другим красителем 1-2 мин., промывают водой и наливают на препарат р-р Люголя (на 1 мин.), после чего дифференцируют спиртом 7 г - 1 мин. до появления серо-фиолетовых струек краски. Затем препарат промывают водой и докрашивают одной из контрастных красок. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, клетки и ткани - в красный. Предложены различные модификации метода Грама - А. И. Синева (применение генцианвиолетовой бумажки вместо карболового р-ра краски), Г. П. Калины, Хаккера (G. J. Hucker), Берк (V. Burke) и др.

Механизм окраски по Граму

Существует несколько теорий механизма окраски по Граму. Предполагалось, что грамположительная окраска обусловлена ненасыщенными жирными к-тами, имеющимися у некоторых бактерий и способными соединяться с йодом, в результате чего «эктоплазма» бактерий становится непроницаемой для спирта и извлечения адсорбированного красителя не происходит.

Другая теория [Стерн, Стерн (E. Stearn, A. Stearn), 1928] связывает механизм окраски по Граму с различиями в кислотно-основных свойствах протоплазмы у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Эти две группы бактерий характеризуются различной изоэлектрической точкой (см.), к-рая у грамположительных видов находится при pH 2,0-3,0, а у грамотрицательных ок. 5. Наряду с этим следует указать, что протравы, применяемые при окраске (йод, пикриновая к-та, бихромат и др.), являются окислителями и имеют тенденцию превращать некоторые комплексы протоплазмы в более кислые соединения, сдвигая изоэлектрическую точку бактерий в кислую сторону. Свойство йода и других протрав сдвигать изоэлектрическую точку в кислую сторону у грамположительных бактерий выражено в большей степени, чем у грамотрицательных, что указывает на определенные хим. различия между этими микробами. Поскольку сродство к красителям и резистентность к обесцвечиванию тем сильнее, чем ниже Изоэлектрическая точка бактерий, а исходное значение pH у грамположительных бактерий ниже, чем у грамотрицательных, и после обработки йодом оно в значительной степени еще снижается, создаются условия для прочной фиксации краски.

Химическая теория [Хенри, Стейси (Н. Henry, М. Stacey), 1943] объясняет грамположительность наличием на поверхности цитоплазмы клетки комплекса из белка и рибонуклеата магния. Этот комплекс можно экстрагировать из тела грамположительных бактерий желчными солями и превратить их в грамотрицательные. Полученный таким способом грамотрицательный вариант можно вновь превратить в грамположительные добавив к нему выделенный экстракт. Превращение грамположительных бактерий в грамотрицательные происходит также при обработке убитых бактерий рибонуклеазой. Присутствие протеин-рибонуклеата магния на поверхности клетки доказывается тем, что успех окраски зависит от структурной целостности бактерий. При механических повреждениях, разрыве оболочки, раздавливании, растирании можно наблюдать превращение поврежденных бактерий в грамотрицательные. Грамположительность сохраняется у морфологически целостных клеток.

Имеются данные, свидетельствующие, что в конечном итоге окраска по Граму зависит от разной проницаемости клеточных стенок у грамположительных и грамотрицательных бактерий. В частности, указывается, что клеточная стенка грамположительных бактерий содержит больше пептидогликана, чем грамотрицательных бактерий, и, что особенно важно, пептидогликаны обеих групп бактерий структурно отличаются друг от друга. В пептидогликане грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus) остатки N-ацетил мурамовой к-ты содержат О-ацетилгруппы в положении C6, что придает молекулам пептидогликана устойчивость, в частности к лизоциму. Высказывается предположение, что обработка спиртом при окраске по Граму уменьшает диаметр пор в пецтидогликановом слое у грамположительных бактерий в большей степени, чем у грамотрицательных.

В силу этого комплекс генцианвиолет - йод при обработке спиртом удерживаемся грамположительной клеткой и извлекается из грамотрицательной.

Библиография: Пирс Э. Гистохимия, пер. с англ., М., 1962; Роуз Э. Химическая микробиология, пер. с англ., М., 1971; .Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М. О. Биргера, с. 23, М., 1973; The bacteria, ed. by I. С. Gunsalus a. R. J. Sta-nier, y. 1, N. Y. - L., 1960; G r a m H. C.J. tiber die isolierte Farbung der Schizomy-ceten in Schnitt-und Trockenpraparaten, Fortschr. Med., Bd 2, S. 185, 1884.

Д. М. Гольдфарб.

Простой метод окраски

Красные и розовые Черные Желтые

Красители кислой природы

Зеленые Черный

Синие Коричневые

Красные Фиолетовые

Красители основной природы

нейтральный красный генциан фиолетовый

пиронин кристаллический фиолетовый

сафранин метиловый фиолетовый

фуксин метиловый зеленый

гематоксилин малахитовый зеленый

Виктория везивин

метиленовый синий хризоидин.

янус зеленый индулин

кислый фуксин нигрозин конго

эритрозин пикриновая кислота

флюоресцин

Интенсивность окрашивающей способности красителя завистит от рН среды: основные красители окрашивают объект тем интенсивнее, чем более щелочная среда, кислые – чем более кислая.

Красители можно разделить на: позитивные и негативные. Позитивные красители окрашивают непосредственно клетки микроорганизмов. Они окрашивают клетки при комнатной температуре в течение 30-60 секунд. Негативные красители окрашивают пространство, окружающее клетки микроорганизмов. В результате клетки выглядят силуэтами на фоне красителя.

На приготовленный и фиксированный мазок нанести несколько капель водного раствора фуксина. Окрашивать 1-2 мин. Смыть краску водой, промокнуть препарат фильтровальной бумагой, досушить на воздухе и микроскопировать.

1. На фиксированный мазок нанести карболово – спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1 –2 мин бумагу снять, а краситель слить.

2. Нанести раствор Люголя на 1 –2 мин.

3. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30 –60с до прекращения отхождения фиолетовых структур красителя.

4. Промыть водой.

5. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1- 2 мин., промыть водой, высушить фильторовальной бумагой и на воздухе, и микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно – фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.

Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшиеся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом. Это зависит от различий в химическом составе и проницаемости клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий пептидогликан многослоен, с ним связаны тейхоевые кислоты.

У грамотрицательных бактерий пептидогликан однослоен, имеется наружная мембрана, в состав которой входят фосфолипиды, липопротеиды, белки и сложный мепополисахарид (ЛПС). Всю наружную мембрану пронизывают белки – порины, обеспечивающие диффузию различных соединений. Таким образом, у граммположительных бактерий создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом.

К грамположительным бактериям относятся старилококки, стрептококки, коринебактерии дифтерии, микобактерии туберкулеза и др., к грамотрицательным – гонококки, менингококки, кишечная палочка и др. Некоторые виды бактерии могут окрашиваться по Грамму вариабельно, в зависимости от возраста, особенностей культивирования и других факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки. Поэтому для окраски нужно брать всегда молодые, 1- суточные культуры.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по Грамму, состоит в “переобесцвечивании” мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицательных бактерий) в результате последующей докраски мазка фуксином грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине–фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.

Контрольные вопросы

1. Методы приготовления прижизненных препаратов.

2. Из каких этапов состоит приготовление окрашенного препарата?

3. Методы окраски мазков.

4. Методика окраски по методу Грама.

5. Красители основной природы.

6. Красители кислой природы.